雞馬立克氏病PCR檢測試劑盒說明書（實時熒光PCR法）
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：雞馬立克氏病PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Marek’s Disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T /盒 ＆ 50T /盒
【預期用途】
馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細胞浸潤和增大，引起肢(翅)麻痹，以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評估有重要指導意義.
【檢驗原理】
本試劑盒針對MDV高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含MDV基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T /盒 | 50T /盒 |
1 | MDV PCR反應液 | 437.5 μL×1管 | 875 μL×1管 |
2 | MDV 混合酶液 | 62.5 μL×1管 | 125 μL×1管 |
3 | MDV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | MDV 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為雞基因組DNA，陽性對照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：
(1) 咽喉拭子，采取時要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液；
(2) 泄殖腔拭子，將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便；
(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。
2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。
4.應避免標本間交叉污染。
5.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | PCR反應液 | 17.5 μL |
混合酶液（Taq酶+UNG酶） | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
(4)蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集MDV熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
陰性（－） | 標本中未檢出MDV |
陽性（＋） | 標本中檢測出MDV |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應進一步使用培養(yǎng)法進行確診。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為102CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項】
1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
2. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
3. 為保證試劑不受標本污染，必須將混合酶液及PCR反應液保存于試劑準備區(qū)。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
7. 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。
